Plasmepsīnu IX un X inhibitoru dizains malārijas zāļvielu izveidei

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• veikta plasmepsīnu IX un X sekvences analīze un salīdzināšana ar plasmepsīna II sekvenci, kuram pieejama kristāliskā struktūra atvērtā konformācijā;.

• balstoties uz veikto sekvences salīdzinājumu un pieejamajām plasmepsīnu II, IV un V kristāliskajā struktūrām, tika identificēti sekvences reģioni kuri nesakrīt ar pieejamajām struktūrām, atrodas tālu no enzīma aktīvā centra, un tādēļ ir iespējama šo sekvences daļu “izgriešana” no homoloģijas modeļa;

• veikta plasmepsīnu IX un X homoloģijas modelēšana, par pamatu izmantojot plasmepsīna II kristāliskās struktūras 4Z22 un 2BJU. Homoloģijas modelēšana veikta izmatojot Schrodinger Prime, Swiss-model, I-Tasser, Modeller, Phyre2, PS2 homoloģijas modelēšanas rīkus;

• iegūto homoloģijas modeļu kvalitāte tika pārbaudīta, veicot 50 ns garas molekulārās dinamikas simulācijas un analizējot sistēmas stabilitāti. Pētāmajām sistēmām tika aprēķināta gan enzīma, gan enzīma aktīvā centra, gan liganda noviržu kvadrātu summa (RMSD), fluktuāciju kvadrātu summa (RMSF), un citi raksturlielumi.

Publicēts: 12.12.2019.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• tika izveidots enzīma aktīvā centra homoloģijas modelis, kurā plasmepsīna II kristāliskās struktūras 4Z22 aktīvā centra aminoskābes (10 A attālumā no liganda) tika mutētas uz atbilstošajām plasmepsīna IX aminoskābēm;

• lai iegūtu plasmepsīna V atvērtās konformācijas struktūru, tika veiktas molekulārās dinamikas simulācijas, kurās oriģinālais ligands 4ZL4 kristāliskajā struktūrā tika aizvietos ar ligandu, kas saistās ar enzīmu atvērtā konformācijā (ligands no kristāliskās struktūras 4Z22);

• tika izvēlēti stabilākie homoloģijas modeļi, un to piemērotība virtuālajam fragmentu skrīningam tika pārbaudīta iedokojot jau zināmus plasmepsīnu inhibitorus un salīdzinot to pozu ar zināmajām plasmepsīnu struktūrām;

• uzsākta mobilitātes vizīte Šveicē, Cīrihes Universitātē.

Publicēts: 12.03.2020.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• zinātniskās vizītes laikā (Cīrihes Universitātē, prof. A. Cahlisch grupā) veikts fragmentu bibliotēku virtuālais skrīnings. Iepriekšējos pētījuma posmos izstrādātie plm IX un X homoloģijas modeļi, kā arī izveidotais plm IV atvērtās konformācijas modelis, izmantotas, lai pārbaudītu ZINC datubāzē pieejamo fragmentu iespējamo saistīšanos. Iegūto datu ticamība novērtēta, konstruējot atgūstamības grafiku;

• veikta fragmentu virtuālā skrīninga rezultātu analīze un atlasīti ~100 fragmenti, kuru iespējamā saistīšanās ar enzīmiem pārbaudīta, izmantojot molekulārās dinamikas simulācijas;

• veicot fragmenta-enzīma kompleksa stabilitātes analīzi, atlasīti 30 fragmenti, kuri iegādāti komerciāli;

• veikta plm IV ekspresija E. Coli šūnās un iegūtā proteīna attīrīšana. Par iegūtā proteīna aktivitāti pārliecinājās, veicot enzimātiskos testus.

Publicēts: 12.06.2020.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• iegādāto fragmentu aktivitātes pārbaudītas eksperimentāli, izmantojot KMR spektroskopijas metodes, kur fragmentu saistīšanos nosaka izmantojot fragmentu signālus (STD, T1ρ un WaterLOGSY eksperimenti). Lai pārliecinātos, ka fragmenti saistās enzīma aktīvajā centrā, veikti konkurences eksperimenti, paraugam pievienojot zināmu plm inhibitoru – pepstatīnu A. Lielākā daļa inhibitoru saistās nespecifiski;

• uzsākts darbs pie perspektīvāka pretmalārijas zāļu vielu mērķa – plm V – ekspersijas E. Coli šūnās. Plm V iegūšana un attīrīšana pārsvarā tiek veikta insektu šūnās, tomēr ir pieejama literatūra arī par plm V ekspresiju E. Coli šūnās. Veikta literatūras analīze un pirmie ekspresijas mēģinājumi, sekojot literatūrā pieejamajiem protokoliem.

Publicēts: 14.09.2020.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• turpināts darbs pie plm V ekspresijas E. Coli šūnās. Plm V ekspresija, izmantojot literatūrā aprakstīto konstruktu un ekspresijas protokolu (10.1016/j.molbiopara.2015.05.004), nav veiksmīga. Veikta ekspresijas apstākļu optimizēšana (ekspresijas temperatūra, IPTG koncentrācija, ekspresijas laiks, šūnu celms), tomēr neizdodas iegūt vērā ņemamus aktīva plm V daudzumus;
• Plm V ekspresija E. Coli šūnās veikta izmantojot citu plm V konstruktu un ekspresijas apstākļus (10.1016/j.molbiopara.2019.111188). Izmantojot šos apstākļus izdodas iegūt aktīvu plm V. Enzīma aktivitāte pārbaudīta veicot enzimātiskos testus.

Publicēts: 14.12.2020.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• veikti virtuālajā skrīningā identificēto aktīvo savienojumu un vairāku LIOS attīstīto inhibitoru ko-kristalizācija ar plm II. Iegūti vairāki inhibitora-plm II ko-kristāli, kuriem uzņemts rentgendifrakcijas ainas, tomēr kristālisko struktūru nebija iespējams noteikt nepietiekamas izšķirtspējas dēļ;
• atkārtota plm V ekspresija, lai iegūtu enzīmu tādā apjomā, kā nepieciešams inhibitoru aktivitātes noteikšanai. Sākta OSI attīstīto plasmepsīnu inhibitoru aktivitātes noteikšana pret plm V. Veikta pdb datubāzes analīze, un apkopota informācija par pieejamajiem atvērtās konformācijas aspartilproteāžu inhibitoriem. Iegūto informāciju plānots izmantot farmakoforā modeļa izveidē;
• turpināta OSI attīstīto plasmepsīnu inhibitoru aktivitātes noteikšana pret plm V. Informācija par aktīvākajiem ne-peptīdiskajiem plm V inhibitoriem izmantota, lai veiktu MD simulācijas, kurās noteiktā plm V kristāliskā struktūra pielāgotos noteiktajiem aktīvajiem ligandiem. Minimizētā plm V struktūra izmantota virtuālā skrīninga modeļa izstrādei.

Publicēts: 15.03.2021.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• Plm V struktūra, kas pielāgota ne-peptīdisku inhibitoru saistīšanai, izmantota virtuālajam skrīningam, kurā pārbaudīta vairāk kā 7 miljonu savienojumu teorētiskā saistīšanās spēja. 30 savienojumi, kuri uzrādīja labāko teorētisko saistīšanās spēju, iegādāti no komerciāliem piegādātājiem un savienojumu aktivitāte pārbaudīta eksperimentāli;
• dalība konferencē “Virtual Helmholtz Drug Discovery Conference”;Plm V virtuālajā skrīningā identificēto inhibitoru analogu meklējumi komerciāli pieejamo savienojumu datubāzēs, un atlase savienojumu iegādei;
• dalība konferencēs un semināros “Hünfeld 2021: Workshop on Computer Simulation and Theory of Macromolecules”, “BioExcel training seminar on QM/MM simulations with GROMACS + CP2K”,  Biacore online semināru sērijā, kas apskatīja virsmas plazmonu rezonanses metodes pielietošanas iespējas zāļu vielu atklāšanā un raksturošanā;
• virtuālajā skrīningā identificēto plm V inhibitoru analogu enzimatiskās aktivitātes pārbaudīšana;
• dalība konferencē “European Chemical Biology Symposium 2021”.

Publicēts: 15.06.2021.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• veikts absolūtās un relatīvās saistīšanās enerģijas aprēķinu metožu literatūras apskats un veikti testa aprēķini ar dažādām metodēm. Salīdzinātas relatīvās un absolūtās “Alķīmiskās brīvās enerģijas aprēķinu metodes (perturbācijas)” un “piltuves metadinamikas” metodes. Apgūta rezultātu apstrādes metodoloģija un izstrādāts kods šādu aprēķinu automatizēšanai;
• dalība EMBL-EBI webināros “A guide to analysing binding sites in protein structures”, “A guide to sequence similarity search for biomolecular sequences”, “A guide to exploring drug-like compounds and their biological targets using ChEMBL”;
• turpināti saistīšanās enerģijas aprēķini izmantojot “piltuves metadinamikas” metodi. Pastiprināta uzmanība pievērsta plasmepsīnu vārsta cilpas dinamikas pētījumiem, kas piedalās inhibitora saistīšanā, un ir viena no kustīgākajām enzīma aktīvā centra daļām;
• vārsta cilpas molekulārās dinamikas aprēķini veikti plasmepsīniem II, V, IX, X un katepsīnam D, lai izprastu iespējamos selektivitāti ietekmējošos faktorus.

Publicēts: 15.09.2021.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• turpināti saistīšanās enerģijas aprēķini, izmantojot “piltuves metadinamikas” metodi;
• optimizēti metadinamikas parametri, kas apraksta aktīvā centra vārsta cilpas kustību inhibitora saistīšanās/atsaistīšanās laikā;
• uzsākts darbs pie zinātniskā raksta, kas apraksta aminohinazolinonu saistīšanās procesu ar plm II, IV, V un catD, un savienojumu selektivitāti ietekmējošos faktorus;
• ekspresēts un attīrīts plasmepsīns II, IV un V, kas tālāk izmantots inhibitoru aktivitātes noteikšanai;
• veikti sagatavošanās darbi plasmepsīna V ekspresijai insektu šūnās.

Publicēts: 15.12.2021.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• izvēlēta metode metadinamikas simulāciju pārrēķināšanai (reweighting), lai kompensētu metadinamikas laikā pieliktā ārējā spēka ietekmi uz simulāciju;
• konstruētas brīvās enerģijas virsmas aminohinazolinonu un plm II, IV, V un catD saistīšanās procesam;
• pabeigts zinātniskais raksts par aminohinazolinonu saistīšanās procesu ar plm II, IV, V un catD;
• veikti sagatavošanās darbi attālinātas/klātienes zinātniskajai vizītei, kuras mērķis ir apgūt virtuālā skrīninga hitu saistīšanās enerģiju aprēķinus, izmantojot metadinamikas metodes. Apskatīta literatūras par pieejamajām metadinamikas aprēķinu metodēm;
• veikti priekšmēģinājumi fragmentu saistīšanās enerģijas aprēķināšanai; ģenerētas iespējamās inhibitoru atsaistīšanās trajektorijas;
• turpināts darbs pie plasmepsīna V ekspresijas insektu šūnās.

Publicēts: 15.03.2022.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• turpināts darbs pie plasmepsīna V ekspresijas insektu šūnās;
• īstenots mobilitātes brauciens uz University College London;
• veikta literatūras izpēte un priekšmēģinājumi, lai izvērtētu iespēju izmantot “reakcijas ceļa metadimanikas” (path metadynamics) metodi inhibitoru saistīšanās simulācijas pētījumos;
• veiktas metadinamikas simulācijas, lai raksturotu iepriekš identificēto plm V inhibitoru saistīšanās procesu – aprēķinātas savienojumu saistīšanās enerģijas, identificēti iespējamie starpstāvokļi, raksturota vārsta cilpas kustība un ietekme uz inhibitora saistīšanos.

Publicēts: 15.06.2022.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• veikta literatūras izpēte un apkopota pieejamā informācija par makrocikliskiem aspartilproteāžu inhibitoriem;
• veiktas metadinamikas simulācijas, lai raksturotu torsijas leņķu brīvās enerģijas profilus lineāriem peptīdiskiem un attiecīgiem makrocikliskajiem aspartilproteāžu inhibitoriem;
• veikts virtuālais skrīnings, lai identificētu iespējamos ne-peptīdiskos plm X inhibitorus. Identificētie savienojumi iegādāti no komerciālajiem piegādātajiem un savienojumu aktivitāte pārbaudīta enzimātiskajos testos;
• dalība konferencē “12th International Conference on Chemical Structures” ar ziņojumu “Exploring aspartic protease inhibitor binding to design selective antimalarials”;
• 17.06.2022. izdevumā “Journal of Chemical Information and Modeling” publicēts raksts “Exploring aspartic protease inhibitor binding to design selective antimalarials”.

Publicēts: 15.09.2022.

Pārskata periodā veiktas šādas pētnieciskās darbības:

• dalība “Zinātnieku nakts” pasākumā 2022.gada 30.septembrī;
• dalība konferencē “ACS Publications Symposium Biological and Medicinal Chemistry” ar ziņojumu “Discovery of non-peptidomimetic plasmepsin V inhibitors”;
• sagatavots zinātniskais raksts par plm V inhibitoru identificēšanu un saistīšanās procesa raksturošanu;
• sagatavots zinātniskais raksts par makrociklisku plm X inhibitoru izstrādi.

Publicēts: 02.05.2023.