Jaunu efektīvu PARP inhibitoru izstrāde

Projekta Nr.
1.1.1.1/19/A/016
Projekta zinātniskais vadītājs
Dr. chem. Pāvels Arsenjans
Projekta īstenošanas laiks
01.08.2020. – 31.07.2023.
Projekta īstenošanas vieta
Latvijas Organiskās sintēzes institūts, Aizkraukles iela 21, Rīga
Projekta kopējās attiecināmās izmaksas
499 207,80 EUR (ERAF finansējums – 324 485,07 EUR)
Projekta mērķis ir atrast jaunu, selēnu saturošu pretvēža zāļvielas kandidātu krūts vēža ārstēšanai. Pašlaik klīnikā izmantojamie medikamenti krūts vēža ārstēsanai izraisa nevēlamus blakusefektus, tāpēc ir aktuāli jaunu ārstēšanas līdzekļu meklējumi (Unmet Medical Need). Projekts balstās uz nesen izstrādāta Se-N+ saiti saturoša savienojuma tālāku attīstīšanu un pilnveidošanu. Atklātais savienojums in vivo pētījumos uzrādīja augstu potenciālu nomākt krūts vēža augšanu un zemu blakusefektu iespējamību. Projekta ietvaros paredzēts veikt gan jaunu savienojumu sintēzi ar mērķi atrast vēl aktīvākus savienojumus, gan padziļināti izpētīt jaunās savienojumu klases darbības mehānismu. Publicēts 31.08.2020.
Paveiktais laika periodā no 01.08.2020. līdz 30.09.2020.

Uzsākts darbs pie izoselenazolopiridīnija, imidazoizoselenazolija un tiazoloizoselenazolija ciklu izveides metodoloģijas izstrādes, baltoties uz etinil-N-heterociklisku savienojumu reakcijām ar selēna(II) un (IV) halogenīdiem. Izvērtēta iespēja ievadīt PEG grupas izoselenazolija 2. pozīcijā. Darbs  pie 14 jaunu Se–N+ saiti saturošu savienojumu sintēzes.

Publicēts 23.11.2020.

Paveiktais laika periodā no 01.10.2020. līdz 31.01.2021.

Tiek turpināts darbs pie izoselenazolopiridīnija, imidazoizoselenazolija un tiazoloizoselenazolija cikla izveides metodoloģijas izstrādes, baltoties uz etinil-N-heterociklisku savienojumu reakcijām ar selēna(II) un (IV) halīdiem.

Ir uzsākti in vitro pētījumi. Iegūto savienojumu preliminārā citotoksicitāte tiek pārbaudīta uz kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomas (MCF-7, HCC1937) un leikēmijas (Jurkat) šūnu līnijām.

Publicēts 23.02.2021.

Paveiktais laika periodā no 01.02.2020. līdz 30.04.2021.

Tiek turpināts darbs pie izoselenazolopiridīnija, imidazoizoselenazolija un tiazoloizoselenazolija cikla izveides metodoloģijas izstrādes, baltoties uz etinil-N-heterociklisku savienojumu reakcijām ar selēna(II) un (IV) halīdiem.

Turpinās  in vitro pētījumi. Iegūto savienojumu preliminārā citotoksicitāte tiek pārbaudīta uz kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomas (MCF-7, HCC1937) un leikēmijas (Jurkat) šūnu līnijām.

Marta mēnesī ir uzsākti darbības mehānisma pētījumi.

Publicēts 21.05.2021.

Paveiktais laika periodā no 01.05.2021. līdz 31.07.2021.

Ir izstrādātā metodoloģija izoselenazolopiridīnija, imidazoizoselenazolija un tiazoloizoselenazolija cikla izveidei apstrādājot etinil-N-heterocikliskus savienojumus ar selēna(II) un (IV) halīdiem. Sintezēti izoselenazolija sāļi ar lipofīlām un hidrofilām PEG grupām, kā arī ar īsiem peptīdiem 2. pozīcijā.

 

Laika posmā no maija līdz jūlijam ir sintezēti 14 jauni savienojumi ar Se–N+ saiti.
No maija līdz jūlija beigām izpētītā 16 savienojumu preliminārā citotoksicitāte uz kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomas (MCF-7, HCC1937) un leikēmijas (Jurkat) šūnu līnijām.
Paraugsavienojumam ar Se–N+ saiti tika pārbaudīta spēja inhibēt vairāku enzīmu aktivitāti ieskaitot PARP izoformas ārēja pakalpojuma ietvaros (BPS Biosciences, ASV). Pateicoties iegūtiem datiem noskaidrota paraugsavienojuma selektivitāte pret PARP1 izoformu.

 

Viens no projekta uzdevumiem ir pārbaudīt izoselenazoliju afinitāti pret kardiolipīnu (unikālu fosfolipīdu mitohondriju membrānās). Projekta ietvaros ir sagatavots manuskripts par jaunu bioanalītisku metodi, kas ļauj izvērtēt endogenu savienojumu un ksenobiotiku spēju saistīties ar kardiolipīnu.

Publicēts 13.08.2021.

Paveiktais laika periodā no 01.08.2021. līdz 31.10.2021.

Uzsākts darbs pie metodoloģijas izoselenazolija sāļu konjugātu sintēzei. Laika posmā no augusta līdz novembrim ir sintezēti 11 jauni savienojumi ar Se–N+ saiti.

 

No augusta līdz oktobra beigām izpētītā 10 savienojumu citotoksicitāte uz kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomas (MCF-7, HCC1937) un leikēmijas (Jurkat) šūnu līnijām. Jaunsintezētiem izoselenazolijiem tika noskaidrota afinitāte pret PARP1 enzīmu.

Periodā no augusta līdz oktobrim tika pārbaudīti 19 savienojumi. Pateicoties mūsu izstrādātai metodei ir uzsākti pētījumi izoselenazoliju sāļu saistīšanas spējas noteikšanai ar kardiolipīnu.

 

Projekta ietvaros ir nopublicēts raksts par jaunu metodi, kas ļauj izvērtēt endogenu savienojumu un ksenobiotiku spēju saistīties ar kardiolipīnu:
P. Dimitrijevs, P. Arsenyan, Cardiolipin in the spotlight: Quantitative analysis and fluorescence-based competitive binding assay, Sensors and Actuators B: Chemical, 346, 2021,130537; doi: 10.1016/j.snb.2021.130537. [IF=7.46].

 

Par pētījumu ir ziņots konferencē:
Targeting Mitochondria 2021 Congress, October 27 – 29, 2021. Mutiskais ziņojums – Novel Method for Evaluating Cardiolipin as a Potential Molecular Drug Target and its Quantitative Analysis. P. Dimitrijevs.

 

Par pētījuma rezultātiem informēta arī plašāka sabiedrība:

Publicēts 12.11.2021.

Paveiktais laika periodā no 01.11.2021. līdz 31.01.2022.

Turpināts darbs pie metodoloģijas izoselenazolija sāļu konjugātu sintēzei. Sintezēti 7 jauni konjugāti, kas satur gan izoselenazolija fragmentu, gan olapariba farmakoforu.

 
Pārbaudīta 16 savienojumu citotoksicitāte uz vairākām šūnu līnijām, ieskaitot krūts karcinomu (MDA-MB-231), plaušu karcinomu (A549), kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomām (MCF-7, HCC1937) un leikēmiju (Jurkat).
 

Turpinām noskaidrot jaunsintezētiem izoselenazolijiem afinitāti pret PARP1 enzīmu. Lai noteiktu precīzu saistīšanas vietu enzīmā, uzsākām enzīmu ekspresiju.

 

Publicēts 10.02.2022.

Paveiktais laika periodā no 01.02.2022. līdz 30.04.2022.

Tika turpināts darbs pie metodoloģijas izoselenazolija sāļu konjugātu sintēzei. Sintezēti 5 jauni konjugāti, kas satur gan izoselenazolija fragmentu, gan rukapariba farmakoforu.

 

Pārbaudīta 11 savienojumu citotoksicitāte uz vairākām šūnu līnijām, ieskaitot krūts karcinomu (MDA-MB-231), plaušu karcinomu (A549), kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomām (MCF-7, HCC1937) un leikēmiju (Jurkat).

 

Balstoties uz ārēja pakalpojuma datiem ir atklāts, ka izoselenazolija sāļi spēj inhibēt PKM2 enzīma aktivitāti 0.35 – 0.9 uM robežās. Jāpiebilst, ka uz doto brīdi literatūrā nav zināms neviens savienojums ar spēju supresēt PKM2 aktivitāti zem 1 uM.

 

Iesniegts starptautiskais patenta pieteikums, kas ietver 23 jaunus savienojumus.

 

Publicēts 10.05.2022.

Paveiktais laika periodā no 01.05.2022. līdz 31.07.2022.

Balstoties uz iegūtiem SAR datiem ir izvēlēti 3 aktīvākie savienojumi padziļinātiem pētījumiem. Sintezēti šie produkti lielākos daudzumos (>100 mg), lai veiktu  in vivo pētījumus.

 

Pārbaudīta 6 savienojumu citotoksicitāte uz vairākām šūnu līnijām, ieskaitot krūts karcinomu (MDA-MB-231), plaušu karcinomu (A549), kardiomiocītu (H9C2), adenokarcinomām (MCF-7, HCC1937), prostatas vēzis (PC3) un leikēmiju (Jurkat).

 

Lai noteiktu precīzu saistīšanas vietu PKM2 enzīmā veicām PKM2 enzīma ekspresiju E coli šūnās. Pēc enzīma izdalīšanas un attīrīšanas noteicām tā struktūru.

 

Publicēts 10.08.2022.

Paveiktais laika periodā no 01.08.2022. līdz 31.10.2022.

Turpināts darbs pie metodoloģijas izoselenazolija sāļu konjugātu sintēzei. Laika posmā no 2022. g. septembra līdz novembrim ir sintezēti 6 jauni konjugāti, kas satur gan izoselenazolija fragmentu, gan rukapariba/olapariba farmakoforu.

Pārbaudīta jaunu savienojumu citotoksiskais efekts uz vēža šūnu līnijām, kā arī spēja inhibēt PARP1, PKM2, PKM1 un PKR enzīmu aktivitāti.

 

Noskaidrots, kā izoselenazolija sāļi spēj ietekmēt piruvāt-atkarīgu šūnu elpošanu, selektīvi inducē ūdeņraža peroksīda producēšanu mitohondrijās un bojā elektronu transportu sistēmu vēžu šūnās.

 

Augusta mēnesī ir iniciēti in vivo pētījumi nosakot farmakokinētikas profilu 4 vielām, lai noskaidrotu līdersavienojumus tālākiem pētījumiem.

 

Publicēts 10.11.2022.

Paveiktais laika periodā no 01.11.2022. līdz 31.01.2023.

Izstrādāta sintēzes metodoloģija plaši pazīstamā PARP inhibitora – rukapariba – selēna homologa izveidei.

 

Uzsākts darbs pie jauna tipa konjugātu iegūšanas, lai apvienotu izoselenazoliju fragmentu ar enzīmu degradējošiem aģentiem.

 

Projekta ietvaros sintezētiem savienojumiem, kas uzrādīja augstu aktivitāti ir atkārtoti pārbaudīta spēja nomākt PARP1 un PKM2 aktivitāti.

 

Izoselenazolija sāļi samazina kopējo NAD/NADH koncentrāciju vēža šūnās vienlaicīgi neizraisot līdzīgu efektu normālajās šūnās. Līdersavienojumi reducē PKM2 enzīma dimēra/tetramēra attiecību, kā arī selektīvi nomāc PKM2 mRNS ekspresiju vēža šūnās.

 

Diviem savienojumiem ir noteikta MTD, hroniskā toksicitāte, un biopieējamība. Ir sagatavots un nosūtīts publicēšanai raksts par rukapariba selēna homologa sintēzi, kā arī sagatavots manuskripts par izoselenazoliju darbības mehānismu noskaidrošanu in vitro.

 

Ir sagatavots un nosūtīts publicēšanai raksts par rukapariba selēna homologa sintēzi, kā arī sagatavots manuskripts par izoselenazoliju darbības mehānismu noskaidrošanu in vitro.

 

Publicēts 10.02.2023.

Paveiktais laika periodā no 01.02.2023. līdz 30.04.2023.
  • Izstrādāta metode un iegūti izoselenazolija konjugāti ar plaši izmantotu PARP1 inhibitoru olaparibu.
  • Sintezētiem konjugātiem, pārbaudīta spēja nomākt PARP1 un PKM2 aktivitāti, kā arī citotoksicitāte uz vēža un normālajām šūnu līnijām.
  • Pabeigti in vitro pētījumi, apkopoti un analizēti iegūtie dati.
  • Veikti in vivo eksperimenti 4T1 karcinomas modelī. Par iekšējo standartu izmantoti olaparibs un doksorubicīns. Publicēts raksts: Lapcinska, S., Arsenyan, P. Method of the synthesis of selenium homolog of rucaparib. Chem Heterocycl Comp 59, 317–321 (2023). https://doi.org/10.1007/s10593-023-03199-7

Publicēts 10.05.2023.

Paveiktais laika periodā no 01.05.2023. līdz 31.07.2023.
  • Īstenots darbs pie jauna tipa izoselenazolija konjugātiem ar enzīmu degradējošu aģentu.
  • Pabeigti in vitro pētījumi, apkopoti un analizēti iegūtie dati.
  • Ar konfokālas mikroskopijas palīdzību ir pierādīta izoselenazoliju spēja apturēt PKM2 translokāciju šūnu kodolā un PARP1 inhibēšana.
  • Publicēts raksts: – Dimitrijevs, P.; Makrecka-Kuka, M.; Bogucka, A.; Hyvönen, M.; Pantelejevs, T.; Arsenyan, P. Development of isoselenazolium chlorides as selective pyruvate kinase isoform M2 inhibitors, Eur. J. Med. Chem., 257, 2023, 115504. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2023.115504

Publicēts 01.08.2023.

Projekta īstenošana noslēgusies!

Projekta īstenošanas rezultātā ir izstrādātas metodes jauno selēnu saturošo savienojumu sintēzei. Ar mērķi atklāt jaunu pretvēža zāļu aģentu iegūto savienojumu aktivitāte ir novērtēta pēc efekta uz PARP enzīmu saimes aktivitāti, mitohondriālo ROS līmeni un citotoksicitātes testiem.

Papildus ir pārbaudīta izoselenazoliju sāļu spēja regulēt vairāku BCL saimes un metabolisku enzīmu paneli. Atklāts, ka savienojumi selektīvi inhibē PARP1 un PKM2 enzīmu aktivitāti. Pēc literatūras datiem atrastie selēnsaturošie savienojumi ir visaktīvākie PKM2 inhibitori.  Noskaidrots gala produktu darbības mehānisms. Veikti in vivo pētījumi.

Rezultāti tika diseminēti divās zinātniskās konferencēs ar mutiskiem ziņojumiem, iznācis sižets LTV1 televīzijā un raksts delfi.lv portālā. Nopublicēti 4 zinātniskie raksti, izgudrojuma īpašuma tiesības ir aizsargātas ar starptautisku patenta pieteikumu.

Atklātie jaunā tipa selēnsaturošie savienojumi kalpos kā pamats uzlabotas ārstēšanas stratēģijas pacientiem ar onkoloģiskām saslimšanām un palielinās Latvijas konkurences potenciālu citu valstu starpā.

Publicēts 10.08.2023.