Zāļu vielu izstrāde selektīvai kadherīnu trans-dimerizācijas kontrolei

Projekta darbības uzsāktas 01.07.2021.

• Tika veikts vairāku kadherīnu saimes proteīnu konstruktu dizains ar mutācijām, kas piemērotas strukturāliem un biofiziskiem pētījumiem.
• Iegūts sintētisks DNS, kas kodē šos kadherīnu konstruktus, un klonēts dažādos ekspresijas vektoros. Veikti ekspresijas testi ar šiem kadherīnu konstrukiem, izmēģinot dažādus vektorus, bakteriju šķirnes un ekspresijas apstākļus.
• Vienam no proteīniem tika optimizēta attīrīšanas pieeja un tas iegūts 10+ miligramu daudzumā.
• Veikts iegūtā kadherīna kristalogrāfisks skrīnings ar mērķi iegūt tā kristālus turpmākiem difrakcijas pētījumiem

Publicēts: 01.10.2021.

• Iegūti viena kadherīnu saimes proteīna kristāli dažādos kristalizācijas apstākļos. Iegūta šī proteīna kristālu pilna difrakcijas aina SLS (Swiss Light Source) sinhrotronā, kā rezultātā aprēķināta tā struktūra.
• Uzsākta fāgu displeja bibliotēku sagatavošana.
• Optimizēta attīrīšanas pieeja vēl vienam kadherīna konstruktam.
• Ar vienu no kadherīnu proteīniem izmēģināts maza izmēra fragmentu bibliotēkas skrīnings, izmantojot kodolmagnētisko rezonansi (KMR).

• Veikta attīrīšana vēl diviem kadherīnu saimes proteīniem.
• Veikts fragmentu saistības skrīnings ar vienu no kadherīniem, izmantojot differential scanning fluorimetry (DSF) metodi.
• Vairāki fragmentu hiti aizsūtīti biofizikālu testu veikšanai uz Creoptix AG (Šveice), lai noskaidrotu to saistības parametrus.
• Iegūti viena kadherīna atvērtās formas (X-dimer) kristāli. Uzsākta šo kristālu optimizācija. Vairākiem kristāliem iegūtas difrakcijas ainas sinhrotronā (SLS, Villigen, Šveice).
• Uzsākti fragmentu hitu testi, izmantojot izotermālo kalorimetriju (ITC).
• Pie projekta izpildes piesaistīts maģistrantūras students.

• Apvienojot ortogonālas biofizikālas metodes, identificēti vairāki mazmolekulu fragmenti, kas saistās ar vienu no kadherīnu saimes proteīniem.
• Iegūta šī kadherīna X-dimēra augstas izškirtspējas (2.0 Å) struktūra ar atvērtu triptofāna saistības kabatu. Struktūra parāda, ka šie kristāli var tikt izmantoti mazmolekulu mērcēšanas eksperimentiem.
• Veikti kadherīna X-dimēra kristālu mērcēšanas eksperimenti ar identificētajiem fragmentiem un kristāli sasaldēti sūtīšanai uz sinhrotronu.
• Iegūta kovalenti modificētus cisteīnus saturoša fāgu displeja bibliotēka ar augstu titru. Šī bibliotēka tiks izmantota peptīdu saistības selekcijai.

• Veikta fragmentos mērcētu kadherīna kristālu difrakcijas ainu iegūšana sinhrotronā. Pamatojoties uz iegūtajiem datiem, veikta mērcēšanas apstākļu optimizācija ar jauniem kristāliem, kam arī iegūti difrakcijas dati.
• Uzsākts fragmentu kristalogrāfiskais skrīnings ar savienojumu kokteiļiem. Mērcētie kristāli sasaldēti un sagatavoti sūtīšanai uz sinhrotronu.
• Noteiktas selektēto fāgu sekvences, kas iegūtas fāgu displeja eksperimentos ar kadherīniem.
• Rezultāti prezentēti Starptautiskā OSI rīkotā konferencē - Drug Discovery Conference, postera formātā, par ko iegūta postera balva strukturālās bioloģijas kategorijā.
• Iesniegts pieteikums XChem infrastruktūras izmantošanai Diamond Light Source sinhrotronā, lai veiktu lielas caurlaidspējas kristaligrāfisko fragmentu skrīningu.

• Veikta fragmentu kokteiļos mērcētu kristālu difrackcijas ainu iegūšana sinhrotronā (Diamond Light Source, Oksforda), izmantojot “serial crystallography” jeb pilnībā automatizētu kristalogrāfiju. Kopumā iegūtas 50 augstas izšķirtspējas datu kopas.
• Veikta šo kristāldifrakcijas datu analīze izmantojot Pandda algoritmu (doi: 10.1038/ncomms15123), kas ļauj noteikt vāju fragmentu saistību. Turpinās izrēķināto elektronu blīvumu karšu analīze.
• Iegūts pozitīvs vērtējums XChem skrīninga pieteikumam.
• Veikta ciklisku peptīdu pull-down analīze ar vienu no kadherīna apakštipiem.

Publicēts: 31.12.2022.