Zāļu vielu izstrāde selektīvai kadherīnu trans-dimerizācijas kontrolei

Projekta darbības uzsāktas 01.07.2021.

• Tika veikts vairāku kadherīnu saimes proteīnu konstruktu dizains ar mutācijām, kas piemērotas strukturāliem un biofiziskiem pētījumiem.
• Iegūts sintētisks DNS, kas kodē šos kadherīnu konstruktus, un klonēts dažādos ekspresijas vektoros. Veikti ekspresijas testi ar šiem kadherīnu konstrukiem, izmēģinot dažādus vektorus, bakteriju šķirnes un ekspresijas apstākļus.
• Vienam no proteīniem tika optimizēta attīrīšanas pieeja un tas iegūts 10+ miligramu daudzumā.
• Veikts iegūtā kadherīna kristalogrāfisks skrīnings ar mērķi iegūt tā kristālus turpmākiem difrakcijas pētījumiem

Publicēts: 01.10.2021.

• Iegūti viena kadherīnu saimes proteīna kristāli dažādos kristalizācijas apstākļos. Iegūta šī proteīna kristālu pilna difrakcijas aina SLS (Swiss Light Source) sinhrotronā, kā rezultātā aprēķināta tā struktūra.
• Uzsākta fāgu displeja bibliotēku sagatavošana.
• Optimizēta attīrīšanas pieeja vēl vienam kadherīna konstruktam.
• Ar vienu no kadherīnu proteīniem izmēģināts maza izmēra fragmentu bibliotēkas skrīnings, izmantojot kodolmagnētisko rezonansi (KMR).

• Veikta attīrīšana vēl diviem kadherīnu saimes proteīniem.
• Veikts fragmentu saistības skrīnings ar vienu no kadherīniem, izmantojot differential scanning fluorimetry (DSF) metodi.
• Vairāki fragmentu hiti aizsūtīti biofizikālu testu veikšanai uz Creoptix AG (Šveice), lai noskaidrotu to saistības parametrus.
• Iegūti viena kadherīna atvērtās formas (X-dimer) kristāli. Uzsākta šo kristālu optimizācija. Vairākiem kristāliem iegūtas difrakcijas ainas sinhrotronā (SLS, Villigen, Šveice).
• Uzsākti fragmentu hitu testi, izmantojot izotermālo kalorimetriju (ITC).
• Pie projekta izpildes piesaistīts maģistrantūras students.

• Apvienojot ortogonālas biofizikālas metodes, identificēti vairāki mazmolekulu fragmenti, kas saistās ar vienu no kadherīnu saimes proteīniem.
• Iegūta šī kadherīna X-dimēra augstas izškirtspējas (2.0 Å) struktūra ar atvērtu triptofāna saistības kabatu. Struktūra parāda, ka šie kristāli var tikt izmantoti mazmolekulu mērcēšanas eksperimentiem.
• Veikti kadherīna X-dimēra kristālu mērcēšanas eksperimenti ar identificētajiem fragmentiem un kristāli sasaldēti sūtīšanai uz sinhrotronu.
• Iegūta kovalenti modificētus cisteīnus saturoša fāgu displeja bibliotēka ar augstu titru. Šī bibliotēka tiks izmantota peptīdu saistības selekcijai.

• Veikta fragmentos mērcētu kadherīna kristālu difrakcijas ainu iegūšana sinhrotronā. Pamatojoties uz iegūtajiem datiem, veikta mērcēšanas apstākļu optimizācija ar jauniem kristāliem, kam arī iegūti difrakcijas dati.
• Uzsākts fragmentu kristalogrāfiskais skrīnings ar savienojumu kokteiļiem. Mērcētie kristāli sasaldēti un sagatavoti sūtīšanai uz sinhrotronu.
• Noteiktas selektēto fāgu sekvences, kas iegūtas fāgu displeja eksperimentos ar kadherīniem.
• Rezultāti prezentēti Starptautiskā OSI rīkotā konferencē - Drug Discovery Conference, postera formātā, par ko iegūta postera balva strukturālās bioloģijas kategorijā.
• Iesniegts pieteikums XChem infrastruktūras izmantošanai Diamond Light Source sinhrotronā, lai veiktu lielas caurlaidspējas kristaligrāfisko fragmentu skrīningu.

• Veikta fragmentu kokteiļos mērcētu kristālu difrackcijas ainu iegūšana sinhrotronā (Diamond Light Source, Oksforda), izmantojot “serial crystallography” jeb pilnībā automatizētu kristalogrāfiju. Kopumā iegūtas 50 augstas izšķirtspējas datu kopas.
• Veikta šo kristāldifrakcijas datu analīze izmantojot Pandda algoritmu (doi: 10.1038/ncomms15123), kas ļauj noteikt vāju fragmentu saistību. Turpinās izrēķināto elektronu blīvumu karšu analīze.
• Iegūts pozitīvs vērtējums XChem skrīninga pieteikumam.
• Veikta ciklisku peptīdu pull-down analīze ar vienu no kadherīna apakštipiem.

Publicēts: 31.12.2022.

• Sagatavoti proteīnu un kristalizācijas apstāķļu šķīdumi XChem fragmentu skrīningam. Paraugi nosūtīti Diamond Light Source partneriem Oksfordā, lai veiktu kristalizācijas atkārtojamības testus. Šiem testiem izstrādāti optimizēti protokoli XChem skrīninga kristalizēšanas un mērcēšanas eksperimentiem.
• Izmēģināts fragmentu skrīnings ar grating-coupled interferometry (GCI) metodi. Uz mikrofluidikas čipa veiksmīgi imobilizēti trīs kadherīnu konstrukti, izmantojot biotīna konjugāciju. Ar šo čipu veikts izmēģinājuma skrīnings vienai 96 fragmentu platei. Balstoties uz šiem datiem, izplānoti tālāki eksperimenti GCI skrīningam.
• Veikti kristalizācijas eksperimenti vēl vienam kadherīnu proteīnu konstruktam.
• Veikti tālāki izotermālās kalorimetrijas (ITC) eksperimenti iepriekš noteiktu fragmentu hitu saistības noteikšanai.
• Uzsākta studenta maģistra darba rakstīšana.

Publicēts: 31.03.2023.

• Veikta kadherīna proteīna kristalizācija XChem programmas ietvaros sadarbībā ar Diamond Light Source sinhrotronu, kā rezultātā iegūti kristāli liela mēroga (high throughput) skrīningam sub-mikrolitru piliena formātā.
• Veikti turpmāki skrīninga eksperimenti ar GCI (granting coupled interferometry), kā rezultātā identificēti potenciāli saistītspējīgi fragmenti. Šiem mazmolekulu fragmentiem veikti validācijas mērījumi ar KMR kā arī kristālu mērcēšanas eksperimentiem.
• Veiktas izmaiņas fāgu displeja selekcijas pieejā, fāgu bibliotēkas aizstājot ar DNS aptamēru bibliotēkām.

Publicēts: 30.06.2023.