Dažādu beta-amiloīda peptīdu sekvenču efekti: fokuss uz īso peptīdu pielietojuma iespējām demences terapijā

NFI_R_2014_023

Vispārīgā informācija
Projekts tiek līdzfinansēts no Eiropas Ekonomikas zonas finanšu instrumenta un Norvēģijas finanšu instrumenta 2009. – 2014. gada perioda programmas LV05 „Pētniecība un stipendijas”.

Projekta Nr. NFI/R/2014/023
Īstenošanas periods: 2015.gada 1.maijs – 2017.gada 30.aprīlis
Līdzfinansējuma saņēmējs: Latvijas Organiskās sintēzes institūts (OSI)
1. partneris: Latvijas Universitāte (LU)
2. partneris: Oslo Universitāte (UiO)
Projekta kopējās izmaksas:  485 999,00 EUR
Norvēģijas finanšu instrumenta līdzfinansējums: 400 949,00 EUR (82.5%)
Valsts budžeta līdzfinansējums: 48 600,00  EUR (10%)
Pašu līdzfinansējums:  36 450,00 (7.5%)

Projekta apraksts
Šī projekta mērķis ir izstrādāt jaunu stratēģiju Alcheimera slimības (AS) ārstēšanai un uzlabot uz izpēti balstītu zināšanu bāzi, mērķa sasniegšanai īstenojot ilgtermiņa sadarbību starp OSI, LU un UIO. Latvijas OSI pētniecības grupas izmantos savu pieredzi strukturālās analīzes veikšanā, kas būs pamats tālāku iteratīvu eksperimentu sākšanai. UIO projekta partneriem nodrošinās savas pieredzes un zināšanu bāzes slimības modeļu un analīzes jomā izmantošanu, savukārt LU iesaistīsies izpētē, nodrošinot pasaules līmenī unikālu laboratorijas peļu pieejamību, izmantojot savu ilggadējo pieredzi uzvedības un kognitīvo testu veikšanā.
Šī Latvijas–Norvēģijas sadarbības pētnieciskā projekta rezultātā plānots noteikt šādas beta-amiloīda īso N-gala peptīdu neiroprotektīvās īpašības:
–    spēju samazināt toksisko beta-amiloīda peptīdu uzkrāšanos šūnās;
–    spēju uzlabot kognitīvās funkcijas.
Iegūtie rezultāti pavērs jaunas iespējas AS ārstēšanā.

  • Projektā paveiktais no 01.01.2017. līdz 30.04.2017.

    Projekta ietvaros ir veikta 15N iezīmēta Aβ40A2V peptīda 1H un 15N atomu ķīmisko nobīžu attiecināšana. Balstoties uz šiem datiem, ir izdevies apstiprināt iepriekš iegūtos Tioflavīna T eksperimentu rezultātus. Turklāt, esam arī pētījuši Aβ40 A2V un Aβ42 WT fibrillu morfoloģiju, izmantojot cietvielu KMR spektroskopiju. Taču pagaidām eksperimenti nav bijuši veiksmīgi, jo apskatītie paraugi saturējuši vairākas fibrillu polimorfās formas. Pašlaik darbs tiek veltīts fibrillizācijas optimizācijai un homogēnu fibrillu paraugu iegūšanai. Esam arī izveidojuši jaunu himērisku proteīnu ar Aβ un šķīstošu zirnekļa (Euprosthenops australis) zīda proteīnu, kas samazina Aβ agregācijas ātrumu. Iegūtie Aβ42WT and Aβ42A2V himēriskie proteīni ir ievadīti Alzeta pumpjos (2006 un 2004 modelis), kas savukārt implantēti 50 un 75 dienu vecās vīriešu dzimuma APP/PS1 +/0 pelēs. Mēs esam arī klonējuši, ekspresējuši un attīrījuši 15 aminoskābēs saturošus WT un A2V Aβ variantus. Saīsinātos peptīdus plānots ievadīt Alzet pumpjos un implantēt pelēs.
    Projekta ietvaros līdz šim ir izstrādāti 12 zinātniskie raksti, kas ir/tiks publicēti tādos augsta līmeņa izdevumos, kā Acta Neuropathologica Communications unNature Communication un klonēti kopskaitā 15 dažādi Aβ peptīdi.
    Pēc projekta beigām pētniecības virziens turpinās – pašlaik tiek veikta zelta zirnekļa Nephila clavipes zīda proteīna un Aβ savienojuma īpašību izpēte proteīna ekspresijai.
    Publicēts 09.05.2017.

  • Projekta rezultāti no 01.11.2016. līdz 31.12.2016.

    Ir iegūts 15N iezīmēts Aβ40A2V peptīds, izmantojot jauno konstruktu, kam uzņemti 2D 15N HSQC, 3D-15N izšķirti NOESY un TOCSY spektri, un attiecinātas tā 15N un 1H ķīmiskās nobīdes. Šie dati ir nepieciešami peptīda dinamikas pētījumiem, ka arī KMR tieši nenovērojamu, lielmolekulāru agregātu strukturāliem pētījumiem. Lai raksturotu Aβ40 un Aβ40A2V peptīdu saistītību ar Cu2+ joniem, ir optimizēti ITC eksperimenta apstākļi. 13C un 15N iezimētam Aβ42 fibrilu paraugam ir uzņemts cietvielu KMR 15N HSQC spektrs.
    Publicēts 16.01.2017.

  • Projekta rezultāti no 01.08.2016. līdz 31.10.2016.

    Šajā laika periodā ir optimizēts jauna Aβ  konstrukta ekspresēšanas un attīrīšanas protokols, kas ļauj iegūt bezprecedenta augstu proteīna daudzumu no gan LB, gan M9 barotnēm. Izmantojot jauno konstruktu, ir uztaisīti vairāki kloni, piemēram, hAβ40, hAβ42, hAβ2-40, hAβ2-42, hAβ40A2V, hAβ42A2V un citi. Nepieciešamie praimeri saīsinātu Aβ1-15 un Aβ1-15A2V peptīdu variantu iegūšanai, arī ir pasūtīti. Papildus minētajam, ir modificēts arī jaunā konstrukta šķīstošais domēns, lai palielinātu tā saistību ar IMAC kolonnu. Dubultiezīmēts (13C un 15N) Aβ42 peptīds ir pagatavots un attīrīts, un paraugs fibrilizēts pie 37ºC.
    Publicēts 10.11.2016.

  • Projekta vadošā pētnieka H.Biverstāla dalība 20. Zviedrijas proteīnu struktūras un funkciju konferencē

  • Projektā paveiktais laika posmā no 01.05.2016. līdz 31.07.2016.

    Pārskata periodā OSI projekta komanda ir klonējusi un sākusi Aβ40, Aβ42, Aβ40A2V, Aβ42A2V peptīdu, kā arī saīsināto Aβ2-40 un Aβ2-42 peptīdu versiju pavairošanu. Jaunās, uzlabotās Aβ42 konstrukcijas peptīdi tiks attīrīti, fibrilēti un tiks lietoti struktūras noteikšanai, izmantojot cietvielu kodolmagnētisko rezonansi. Papildus minētajam, pārskata periodā tika izmantotas dažādas KMR metodes, lai raksturotu mijiedarbību starp Aβ40 un heksapeptīdiem.
    Publicēts 01.08.2016.

  • Publicēts video par EEZ un Norvēģijas finanšu instrumentu ieguldījumu

  • Projektā paveiktais laika posmā no 31.01.2016. līdz 30.04.2016.

    WP1
    Pārskata periodā OSI ir radītas 2 jaunu peptīdu konstrukcijas, balstoties uz Aβ(A2V)1-6  ar diviem dažādiem peptīdu marķieriem (TAT-Aβ(A2V)1-6 un AntP-Aβ(A2V)1-6), ar mērķi sekmēt savienojumu nokļūšanu smadzenēs, pārvarot smadzeņu-asinsvadu barjeru. Papildus minētajam, izstrādāta jauna beta-amiloīdu un to variantu overekspresijas metode, un visi minētie savienojumi pašlaik atrodas izpētes procesā.
    WP2
    Lai izpētītu dažādu mutēto beta amiloīdu peptīdu pozitīvās īpašības, projekta norvēģu partnera profesora J. Pankes laboratorijā notiek in vivo eksperimenti (ar dažādiem beta-amiloīda peptīdiem pildītu Alzet pumpju ķirurģiska implantēšana).LU pētnieki veic īso peptīdu pētniecību, izmantojot in vivo modeļus (īstenojot uzvedības un kognitīvos testus) un ex vivo metodes (imūnhistoķīmijas metode un Western blota metode).Pārskata periodā turpinājās LU personāla stažēšanās Olso Universitātē, lai iegūtu pieredzi dzīvnieku datu bāzes apgūšanā, Alzet pumpju izmantošanā peļu operācijās, kā arī tika veikta metožu validācija.
    Publicēts 10.05.2016.

  • Projektā paveiktais no 01.11.2015. līdz 31.01.2016.

    WP1
    Pārskata periodā tika pabeigta peptīdu hAβ42 un mAβ4 klonēšana, kā arī to savstarpējo izoformu kombināciju konstruēšana, kā arī tika radīti trīs mutantpetīdi (hAβ42R5G, hAβ42Y10F, hAβ42H13R). Papildus minētajam, radīts peptīds Aβ42. Visi četri savienojumi tika radīti un attīrīti saskaņā ar iepriek;š izstrādātajiem protokoliem, un tiem piemīt līdzīgas kinētiskās īpašības kā hAβ42WT, hAβ42A2V un hAβ42A2T.
    WP2
    Lai nogādātu WP1 ietvaros radītos īsos peptīdus laboratorijas peļu smadzenēs, tika lietoti īpaši sūkņi (Alzet pumpji), kas, ievietoti zemādas implantu veidā, sāk sūtīt peptīdus uz smadzenēm, izmantojot kanulu. Sākotnēji projekta gaitā radās grūtības nostiprināt kanulu peles galvaskausā, kas radīja papildus riskus dzīvnieka smadzeņu traumēšanai, tādēļ norvēģu partnera prof.J.Pankes laboratorijā tika radīta jauna metode kanulas nofiksēšanai. Jaunās metodes pielietošana atvieglo eksperimentu veikšanu un samazina to dzīvnieku skaitu, kuri pētniecības gaitā var gūt smadzeņu bojājumus.
    Publicēts 10.02.2016.

  • Projekta vadošā pētnieka H.Biverstāla dalība konferencē ISMAR 2015

  • Paveiktais OSI laika posmā no 01.08.2015. līdz 31.10.2015.

    Pārskata periodā OSI producēti, attīrīti un pētīti dažādi beta-amiloīda peptīdu sekvenču  varianti.
    Tālākai izpētei tika iegūti šādi peptīdi:
    1) beta-amiloīda peptīds 1-40;
    2) beta-amiloīda peptīds 1-42;
    3) beta-amiloīda peptīds 1-6 ar mutāciju A2V;
    4) beta-amiloīda peptīds 1-6 ar mutāciju A2T.
    Papildus minētajam, pārskata periodā veikta beta-amiloīda peptīda 1-42 un beta-amiloīda peptīda 1-6 ar mutāciju A2V  savstarpējās mijiedarbības sākotnējā izpēte.
    Publicēts 09.11.2015.

  • Paveiktais OSI laika posmā no 01.05.2015. līdz 31.07.2015.

    Veikts dažādu beta-amiloīda peptīdu sekvenču ekspresijas konstrukciju dizains un sagatavošana:
    1) beta-amiloīda peptīds 1-40;
    2) beta-amiloīda peptīds 1-42;
    3) beta-amiloīda peptīds 1-42 ar mutāciju A2V;
    4) beta-amiloīda peptīds 1-42 ar mutāciju A2T.
    Uzsākts darbs pie šo peptīdu producēšanas un attīrīšanas.
    Publicēts 10.08.2015.